Высокоскоростная сканирующая электронная микроскопия: панорамная съёмка площадей в квадратные миллиметры с нанометровым разрешением

Ключевой характеристикой сканирующего электронного микроскопа традиционно считается пространственное разрешение — минимальный размер деталей, различимых на одиночном изображении. Однако в ряде современных задач определяющим становится другой параметр — производительность: требуется получить тысячи изображений с нанометровым разрешением, покрыть ими площадь в единицы и десятки квадратных миллиметров и объединить их в бесшовную панораму. Такие требования характерны для объёмной электронной микроскопии биологических объектов, ультраструктурной патологии и послойного анализа интегральных схем.
На классическом СЭМ такая съёмка занимает дни и недели. В статье разберём, из чего складывается время съёмки, почему нельзя просто «сканировать быстрее» и какие инженерные решения позволяют однолучевому микроскопу собирать данные в несколько раз быстрее — на примере высокоскоростного СЭМ IQSCAN HEM60.

Классический СЭМ задумывался как инструмент для одиночного кадра. Оператор выбирает участок образца и подбирает режим съёмки под конкретную задачу: ускоряющее напряжение, ток пучка, рабочее расстояние, детектор, увеличение, фокусировку и коррекцию астигматизма, яркость и контраст, скорость развёртки. Итоговое изображение записывается при медленной развёртке с максимальным разрешением. Площадь такого кадра — от единиц до сотен микрометров, и его съёмка занимает от секунд до минут.

Ряд современных задач предъявляет иные требования. В нейробиологии строят карты связей нейронов (коннектомы): нужно проследить каждый аксон и каждый синапс в объёме ткани, а это сотни и тысячи последовательных срезов. В патологии хотят видеть ультраструктуру целого среза, а не случайно выбранного поля. В анализе микросхем снимают весь кристалл, слой за слоем, с нанометровым разрешением. Во всех случаях результат — не картинка, а массив данных.

Оценим масштаб. Для надёжного разрешения клеточных мембран и синаптических везикул шаг сканирования (размер пикселя) не должен превышать примерно 4 нм. Тогда площадь 1 × 1 мм — это 250 000 × 250 000 = 6,25·10¹⁰ пикселей, или около 62 ГБ данных при 8 битах на пиксель. Чистое время сканирования такой площади при шаге сканирования 4 нм зависит только от времени выдержки на пиксель (dwell time):

• 1 мкс — ≈ 17 ч 22 мин (качественный кадр на обычном СЭМ);
• 100 нс — ≈ 1 ч 44 мин (быстрая развёртка обычного СЭМ);
• 40 нс — ≈ 42 мин (высокоскоростной СЭМ, рабочий режим);
• 10 нс — ≈ 10 мин (высокоскоростной СЭМ, предельный режим).

Для одного слоя разница между часами и минутами неприятна, но терпима. Для объёмной задачи она становится принципиальной. Серия из 1000 срезов по 0,25 мм² при скорости сканирования 100 нс на пиксель сканируется около 18 суток непрерывной работы, при 1 мкс — полгода. Поэтому для таких задач скорость сбора данных важнее рекордного разрешения в одном кадре.

На первый взгляд достаточно уменьшить время на пиксель — и съёмка ускорится пропорционально. На практике обычный СЭМ упирается сразу в три ограничения: физику сигнала, быстродействие электроники и время на вспомогательные операции между кадрами.

Сигнал и дробовой шум. Изображение в СЭМ строится из подсчёта электронов, пришедших на детектор за время выдержки. Число электронов пучка, упавших в один пиксель:

N = I_p · τ / e

где I_p — ток пучка, τ — время на пиксель, e — заряд электрона. При токе 1 нА и выдержке 10 нс это всего около 60 электронов. Детектора достигает лишь часть из них: долю определяют коэффициент эмиссии вторичных или отражённых электронов и эффективность сбора.

Здесь вступает в силу дробовой шум — шум, возникающий из-за того, что ток состоит из отдельных частиц. Электроны прилетают в случайные моменты времени, поэтому даже при идеально стабильном пучке число электронов в одинаковых пикселях разное. Если в среднем на пиксель приходится 100 электронов, реальное число колеблется примерно на ±10. Этот шум заложен в самой природе сигнала: убрать его улучшением электроники нельзя, можно только собрать больше электронов. Название пришло из радиотехники: шум в электронных лампах сравнивали со звуком дроби, сыплющейся на жесть.

Регистрация электронов — случайный процесс, подчиняющийся статистике Пуассона. Поэтому отношение сигнал/шум растёт лишь как корень из числа зарегистрированных электронов:

SNR ∝ √(N · δ · η)

где δ — выход сигнальных электронов, η — эффективность детектора. Уменьшив время на пиксель в 10 раз, мы теряем в три с лишним раза по отношению сигнал/шум. Компенсировать потерю можно только двумя способами: увеличить ток в пятне пучка, не расширяя само пятно, или терять меньше сигнала по дороге к детектору и в нём самом.

Быстродействие тракта. При 10 нс на пиксель пучок нужно перемещать с частотой 100 МГц, а детектор, усилитель и АЦП должны успевать за ним. Магнитные катушки развёртки обычного СЭМ работают на частотах порядка 20 МГц. Свечение сцинтиллятора тоже затухает не мгновенно. Если сканировать быстрее, чем отвечает тракт, изображение «смазывается» вдоль строки, а сама строка искажается.

Вспомогательные операции. Кроме сканирования, время уходит на:

• перемещение столика к следующему полю и ожидание его механической стабилизации (затухания колебаний и дрейфа);
• автофокус и коррекцию астигматизма на каждом поле;
• обратный ход развёртки в начале каждой строки;
• перекрытие соседних кадров, необходимое для сшивки;
• смену образца и откачку камеры.

Чем меньше единичное поле, тем больше кадров и тем больше доля времени на них. На обычном СЭМ большое поле оплачивается искажениями на краях кадра: пучок падает наклонно, растут внеосевые аберрации и падает резкость. Такие кадры плохо сшиваются, и приходится снимать мелкими полями с большим перекрытием.

Ускорить сбор данных можно двумя принципиально разными способами.

Многолучевые СЭМ расщепляют пучок на десятки параллельных (так устроены, например, Zeiss MultiSEM 505 и 506 с 61 и 91 пучком соответственно) и снимают столько же кадров одновременно. Суммарная скорость у них рекордная, даже если каждый пучок сканирует медленно. Но у такого подхода есть цена. Энергия падения обычно ограничена узким диапазоном в единицы киловольт, ток в каждом пучке мал, а соседние пучки нужно разделять на детекторе. Образец должен быть плоским, а прибор остаётся узкоспециализированным и очень дорогим.

Высокоскоростные однолучевые СЭМ идут другим путём: ускоряют каждое звено одной колонны. Ярче источник, быстрее развёртка, эффективнее детектор, шире поле без искажений, точнее столик. По суммарной скорости сбора данных такой прибор уступает многолучевому, зато сохраняет гибкость обычного СЭМ:

• широкий диапазон энергий — от сотен вольт до 30 кВ;
• ток пучка от десятков пикоампер до десятков наноампер;
• возможность выбора детектора для получения сигнала вторичных или отражённых электронов;
• возможность работать как с биологическими срезами, так и с микросхемами.

Для большинства лабораторий это разумный баланс: один прибор по скорости сопоставим с несколькими обычными СЭМ и при этом остаётся универсальным.

Разберём решения на примере IQSCAN HEM60. Каждое из них снимает одно из ограничений, описанных выше: развёртка и оптика работают на скорость и поле зрения, источник, детектор и торможение пучка — на сигнал, столик — на сшивку.

Электростатическая развёртка пучка

В обычном СЭМ пучок отклоняют магнитные катушки. Катушка обладает индуктивностью, а магнитопровод — гистерезисом и вихревыми токами. Поле не успевает за током, и на высоких частотах развёртка становится нелинейной: пиксели в начале строки «сжимаются», кадр искажается.

В IQSCAN HEM60 вместо катушек применена пятиступенчатая система электростатических дефлекторов. Поле между пластинами повторяет напряжение практически без задержки, гистерезиса нет, а само поле однородно. Это позволяет сканировать с частотой до 100 МГц и временем выдержки от 10 нс на пиксель. Реализация такой системы технически сложнее: требуются быстродействующие высоковольтные драйверы и прецизионная согласованная сборка нескольких ступеней дефлекторов, поэтому в стандартных микроскопах по-прежнему применяют более простые магнитные катушки.

Источник Шоттки повышенной яркости

Разрешение задаёт диаметр пятна, а сигнал — ток в этом пятне. Связь между ними определяет яркость источника B:

I_p ≈ (π²/4) · B · d² · α²

где d — диаметр пятна, α — угол схождения пучка. Чтобы получить больше тока при том же пятне, нужен более яркий источник. В HEM60 используется катод Шоттки со специально отобранным остриём: угловая плотность тока у него примерно в 3 раза выше, чем у стандартного. Для многочасовой съёмки не менее важна стабильность: дрейф эмиссии не более 1 % за 24 часа. Иначе яркость кадров в начале и в конце серии будет различаться, и сшитая панорама получится неоднородной по яркости.

Детектор прямой регистрации электронов

В классическом детекторе Эверхарта — Торнли сигнал проходит цепочку преобразований: электрон → сцинтиллятор → фотон → световод → фотокатод ФЭУ → электроны → усилитель. На каждом этапе теряется часть сигнала и добавляется шум, а послесвечение сцинтиллятора ограничивает скорость.

Детектор прямой регистрации (Direct Electron Detector, DED) устроен проще: электрон попадает прямо в чувствительный слой полупроводника и рождает там заряд, который сразу усиливается. Сцинтиллятора и оптического преобразования нет, потерь меньше, быстродействие выше. Подобные детекторы давно стали стандартом в крио-ПЭМ, 4D-STEM и EBSD, где тоже важен каждый электрон. В высокоскоростном СЭМ они дают приемлемое отношение сигнал/шум при выдержке в десятки наносекунд. Измерения на микросхеме (BSE, 10 кВ, ×1500) показывают SNR ≈ 20,6 при 40 нс и ≈ 38,1 при 120 нс на пиксель.

Торможение пучка потенциалом на столике

Биологические срезы и верхние слои микросхем исследуют при низкой энергии электронов, единицы киловольт и ниже. Так сигнал идёт из тонкого приповерхностного слоя, а зарядка и радиационные повреждения минимальны. Но медленный пучок хуже фокусируется, а сигнальные электроны плохо долетают до детектора.

Решение — подать на столик отрицательный потенциал. Пучок проходит колонну с высокой энергией и тормозится лишь перед самым образцом. Энергия падения равна:

E_L = e · (V₀ − V_s)

где V₀ — ускоряющее напряжение, V_s — тормозящий потенциал на столике. То же поле ускоряет вылетевшие из образца вторичные и отражённые электроны обратно в колонну, к детекторам. В результате растут и разрешение, и собираемый сигнал. В HEM60 режим торможения покрывает энергии падения от 100 эВ до 6 кэВ; разрешение — 1,5 нм при 1 кВ и 1,3 нм при 3 кВ во вторичных электронах.

Иммерсионный объектив и динамическая оптическая ось

Иммерсионная линза выпускает магнитное поле за пределы полюсного наконечника, и образец оказывается «погружённым» в него. Эффективное фокусное расстояние сокращается, а сферическая и хроматическая аберрации падают — особенно заметно при низких энергиях. В HEM60 линза комбинированная: магнитное поле дополнено электростатическим.

У широкого поля своя проблема: чем дальше пучок от оптической оси, тем сильнее внеосевые аберрации и наклон пучка. Динамическая оптическая ось решает её так: отклонение пучка и поле объектива согласованно подстраиваются в каждой точке растра, и пучок остаётся перпендикулярным поверхности даже на краю поля. В итоге максимальное поле составляет 1 × 1 мм, а при шаге сканирования 4 нм — 64 × 64 мкм в одном кадре. Геометрические искажения не превышают 0,01 %.

Точный столик и сшивка

Панорама собирается из сотен и тысяч кадров, и качество сшивки зависит от того, насколько точно столик приходит в заданную точку. У HEM60 моторизованный столик с обратной связью: ход 110 × 110 мм, повторяемость ±0,6 мкм по X и ±0,3 мкм по Y, опционально — пьезопривод. Автофокус учитывает неплоскостность образца между центром и краями поля. Благодаря этому перекрытие соседних кадров можно делать минимальным, а сшивка не требует ручной подгонки.

Вместе эти решения дают скорость сбора данных 2 × 100 Мпикс/с по двум каналам и кадр до 16K × 16K пикселей. При одинаковом покрытии и качестве изображения HEM60 снимает ту же площадь за 35 минут вместо 180 у обычного автоэмиссионного СЭМ.

Объёмная электронная микроскопия (volume EM) восстанавливает трёхмерную структуру образца по серии последовательных изображений. Образец сначала фиксируют глутаровым альдегидом, контрастируют четырёхокисью осмия, обезвоживают и заливают в смолу. Дальше есть несколько способов получить сами сечения:

• серийные ультратонкие срезы, полученные на внешнем ультрамикротоме (например, UM10) и исследуемые в ПЭМ (ssTEM);
• сканирование поверхности блока с встроенным ультрамикротомом (SBF-SEM);
• послойное травление фокусированным ионным пучком (FIB-SEM, например, IQSCAN FIB55);
• массивы серийных срезов на твёрдой подложке для СЭМ (array tomography).

Серийные срезы для ПЭМ — классический метод с лучшим разрешением в плоскости среза. Но срезы лежат на сеточках с опорной плёнкой: перемычки закрывают часть поля, плёнка легко рвётся, а в колонну загружается небольшое число сеток. Для сотен срезов это медленно и трудоёмко.

SBF-SEM снимает торец блока прямо в камере микроскопа и срезает слой за слоем. Серия изображений получается идеально совмещённой, но образец разрушается: переснять участок с другими параметрами нельзя. Кроме того, съёмка и резка идут поочередно, и микроскоп простаивает во время резки.

FIB-SEM даёт самый тонкий шаг по глубине — единицы нанометров, что позволяет получать изотропные воксели. Обратная сторона — небольшой объём: обычно десятки микрометров по каждой оси. Это инструмент для отдельной клетки или синапса, а не для целого участка ткани.

Массивы серийных срезов сочетают большую площадь и сохранность образца. Ленты срезов толщиной в десятки нанометров готовят на ультрамикротоме и укладывают на кремниевую пластину. Срезы не разрушаются: их можно сначала осмотреть с низким разрешением, а потом переснять интересные участки детально, даже через месяцы. Кремний проводит, поэтому зарядка минимальна, а поле зрения ничем не перекрыто. Слабое место метода как раз в объёме съёмки: на одной пластине сотни срезов, и обычному СЭМ на них нужны недели.

Именно здесь высокоскоростной СЭМ даёт наибольший выигрыш. Работа с пластиной в IQSCAN HEM60 полностью автоматизирована:

1. Пластина диаметром до 4 дюймов (опционально 6) загружается через шлюз; смена образца занимает менее 15 минут.
2. По обзорному изображению программа распознаёт и упорядочивает срезы.
3. Оператор выбирает область интереса на одном срезе, и она автоматически переносится на всю серию.
4. Съёмка идёт без оператора, с автофокусом, автостигматором и авторегулировкой яркости и контраста, в режиме 24/7.
5. Кадры сшиваются в панорамы, а серия панорам — в трёхмерную модель.

Тот же подход позволяет совмещать электронные изображения со световой и флуоресцентной микроскопией (корреляционная микроскопия, CLEM): сначала найти меченые клетки в световом микроскопе, затем изучить их ультраструктуру в СЭМ.

Мозг мыши: 75 срезов за восемь часов

Серия из 75 срезов ткани мозга была снята целиком с шагом сканирования 1 нм. Режим: детектор отражённых электронов, 1,5 кВ, 80 нс на пиксель. Вся съёмка заняла около 8 часов — одну ночь автоматической работы. На изображении различимы миелиновые оболочки аксонов, митохондрии и синаптические контакты; такие данные подходят для сегментации нейронов и построения карт связей.

Ультраструктурная патология

В клинической патологии электронную микроскопию традиционно выполняют на ПЭМ. Высокоскоростной СЭМ показывает те же структуры на срезах, лежащих на кремниевой подложке, но снимает срез целиком. Патолог видит не отдельные поля, а панораму, по которой можно оценить распространённость поражения и точно локализовать электронно-плотные депозиты. Типичные задачи:

• почки — дифференциальная диагностика гломерулопатий (болезнь минимальных изменений, мембранозная нефропатия, синдром Альпорта, болезнь Фабри) и оценка повреждения подоцитов;
• печень — болезни накопления и наследственные нарушения обмена (гликогенозы, болезни Гоше и Нимана — Пика, болезнь Вильсона);
• опухоли — отличие низкодифференцированной карциномы от саркомы по десмосомам и тонофиламентам, поиск меланосом при меланоме;
• нервная ткань — нейродегенеративные заболевания и ультраструктурные признаки опухолей мозга.

По сравнению с ПЭМ такая схема даёт четыре преимущества: сотни срезов за одну загрузку, быструю съёмку с хорошим контрастом, поле без перемычек сетки и высокую степень автоматизации. По сравнению со световой микроскопией — разрешение, достаточное, чтобы различать органеллы и типы клеток.

Реверс-инжиниринг микросхем

При анализе интегральных схем кристалл послойно вскрывают и каждый слой снимают целиком. По изображениям восстанавливают топологию и схему, поэтому кадры должны сшиваться без сдвигов: ошибка в несколько пикселей ломает трассировку проводников. Здесь важны все три свойства высокоскоростного СЭМ: скорость, малые искажения кадра и точность столика.

Сравнение съёмки одного и того же кристалла (область 1,51 × 1,74 мм, шаг сканирования 16 нм, единичный кадр 12 288 × 12 288 пикселей, поле 128 мкм):

• IQSCAN HEM60 — 40 нс на пиксель, общее время 21 мин 34 с;
• стандартный СЭМ — 800 нс на пиксель, общее время 3 ч 01 мин.

Для детального анализа слои снимали с шагом сканирования 6 нм и полем 48 мкм (BSE, 160 нс на пиксель). Слой поликремния занял 1209 кадров и 3 ч 39 мин, слой металлизации M1 — 1178 кадров и 3 ч 37 мин. Автофокус сохранял резкость в каждом поле, а перекрытие соседних кадров оставалось стабильным по обеим осям.

Скорость стандартного СЭМ ограничена не одним узлом, а всей цепочкой: током пучка, быстродействием развёртки и детектора, искажениями на краях поля и точностью столика. Высокоскоростной однолучевой СЭМ снимает все эти ограничения одновременно и при этом сохраняет универсальность обычного микроскопа. В итоге задачи, которые раньше требовали недель работы или нескольких приборов, решаются за одну-две ночи автоматической съёмки.

Основные области применения:

• объёмная электронная микроскопия и коннектомика;
• ультраструктурная патология и корреляционная микроскопия;
• послойный анализ и реверс-инжиниринг микросхем;
• любые задачи, где нужны панорамы в сотни микрометров и миллиметры с нанометровым разрешением.

IQSCAN HEM60 выпускается в трёх версиях. HEM60-Semi рассчитан на полупроводники и даёт 1,5 нм при 1 кВ. HEM60-Bio оптимизирован для биологических срезов и 3D-реконструкции. HEM60-Lite отличается упрощённым управлением и работает при 6–30 кВ. Для задач, где нужна локальная изотропная томография или подготовка ламелей, его дополняет двухлучевой IQSCAN FIB55.